菌落總數(shù)(Totalcoliforms)是判定水質(zhì)被細(xì)菌污染程度的重要指標(biāo)之一，其測(cè)定方法也有一定的標(biāo)準(zhǔn)。平皿計(jì)數(shù)法是早期傳統(tǒng)的水中菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，其應(yīng)用研究也比較多，如錢(qián)冬梅應(yīng)用平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定了生活飲用水中的菌落總數(shù)。這種方法實(shí)驗(yàn)步驟較為繁瑣，對(duì)操作人員的專(zhuān)業(yè)水平要求比較高，不適用于應(yīng)急快速檢測(cè)，無(wú)法對(duì)水的衛(wèi)生狀況做出快速評(píng)價(jià)。

　　酶底物法是近些年來(lái)新興的水中菌落總數(shù)檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果易判斷，適用于快速檢測(cè)。但不少用戶對(duì)此種方法存疑，不知道這種方法出來(lái)的檢測(cè)結(jié)果是否科學(xué)準(zhǔn)確，下面優(yōu)爾普就以平皿計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，用酶底物法程控定量封口機(jī)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)比。

立科酶底物法程控定量封口機(jī)

酶底物法快速檢測(cè)水中菌落總數(shù)實(shí)驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)操作部分

1、實(shí)驗(yàn)原理

　　酶底物法使用的復(fù)合酶技術(shù)培養(yǎng)基包含多種獨(dú)特的酶物質(zhì)，每種酶物質(zhì)都針對(duì)不同的細(xì)菌酶設(shè)計(jì)(包含普遍的水介傳播細(xì)菌)，所有的酶底物被分解時(shí)均產(chǎn)生相同的信號(hào)。在檢測(cè)菌落總數(shù)時(shí)，這個(gè)信號(hào)顯示為365納米紫外4O城鎮(zhèn)供水NO.22013燈下的熒光。

2、材料與試劑

　　立科定量盤(pán)、lmL移液管或移液槍、10mL移液管或移液槍、培養(yǎng)箱(35±1)、6瓦366FIITI紫外燈、紫外燈箱(23cmx30onx17on1)、無(wú)菌水。

3、方法步驟

酶底物法檢測(cè)方法操作步驟

(1)首先向100mL裝有固體培養(yǎng)基的瓶中加入無(wú)菌水至刻度，搖勻，制成液體培養(yǎng)基，然后放置在冰箱中保存，使用有效期為5天。見(jiàn)圖1。

(2)取1mL水樣及9mL液體培養(yǎng)基倒入立科定量盤(pán)中。見(jiàn)圖2。

(3)將定量盤(pán)蓋好，在水平桌面上旋動(dòng)將所有水樣分配到定量盤(pán)的孔中(孔中的氣泡不會(huì)影響結(jié)果)。見(jiàn)圖3。

(4)將定量盤(pán)豎起呈垂直90度，將多余的水樣由盤(pán)內(nèi)海綿吸收。見(jiàn)圖4。

(5)將定量盤(pán)緩慢翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，于培養(yǎng)箱中(35±0.5)培養(yǎng)48h(若結(jié)果為可疑陽(yáng)性則延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至72h)。見(jiàn)圖5。

(6)計(jì)數(shù)：培養(yǎng)完成后將培養(yǎng)盤(pán)蓋打開(kāi)，用紫外燈在定量盤(pán)上方13on處照射，數(shù)顯熒光的孔數(shù)。對(duì)照MPN表得出結(jié)果。注意：海綿條顯熒光不必記錄在讀數(shù)范圍內(nèi)。由于本方法的最大檢測(cè)上限為738MPN/mL，如需稀釋時(shí)，將結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即為報(bào)告讀數(shù)(如稀釋l0倍時(shí)的操作為：加入0.1mL樣品和9.9mL液體培養(yǎng)基)。

二、結(jié)果與分析

1、盲樣比對(duì)實(shí)驗(yàn)--T檢驗(yàn)分析

　　選取三個(gè)水質(zhì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)比同一盲樣(標(biāo)準(zhǔn)試劑)進(jìn)行酶底物法和平皿計(jì)數(shù)法比對(duì)試驗(yàn)，具體試驗(yàn)結(jié)果如圖。

EPA標(biāo)準(zhǔn)盲樣檢測(cè)結(jié)果

　　對(duì)比以上酶底物法和平皿計(jì)數(shù)法檢出共160個(gè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)，兩種方法的配對(duì)T檢驗(yàn)結(jié)果如下表。

配對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果

　　標(biāo)配比變量差值的T檢驗(yàn)結(jié)果，Mean均值之間的差值為-1.78750，Std.Deviation差值的標(biāo)準(zhǔn)差16.10385，Std.ErrorMean差值的調(diào)準(zhǔn)誤為1.80047，95%ConfidenceIntervaloftheDifference置信區(qū)間上下限為-5.37124和1.79624，t-valuet值為-0.993，df自由度為79，Sig(2-tailed)雙尾T檢驗(yàn)的結(jié)果，獲得t值的概率P值為0.324，檢驗(yàn)結(jié)果表明酶底物法和平皿計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差別(P<0.50)。

2、水樣檢測(cè)--線性回歸分析

　　采集地表水水樣進(jìn)行檢測(cè)，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性和方便統(tǒng)計(jì)，要求檢測(cè)高、低濃度兩個(gè)水樣，同時(shí)，要求低濃度水樣的MPN值控制在50MPN/ml左右，高濃度水樣的MPN值控制在100MPN/ml左右，分別從國(guó)內(nèi)9個(gè)地區(qū)采集水樣，試驗(yàn)結(jié)果如圖。

實(shí)驗(yàn)室水樣檢測(cè)結(jié)果

　　對(duì)以上9家實(shí)驗(yàn)室用酶底物法和平皿計(jì)數(shù)法共1160個(gè)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行線性回歸統(tǒng)計(jì)分析，兩種方法線性回歸分析見(jiàn)下表。

檢測(cè)結(jié)果線性回歸統(tǒng)計(jì)分析

　　從圖表中可知，標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)Beta為0.95，表明兩組數(shù)據(jù)相關(guān)性較好，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果具有可比性。檢驗(yàn)結(jié)果P=0.00，均小于0.05，表明兩種方法在檢測(cè)菌落總數(shù)時(shí)沒(méi)有顯著差異性，具有等效性。此結(jié)果說(shuō)明酶底物法的測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可以替代平皿技術(shù)發(fā)作為水中菌落總數(shù)的測(cè)定方法。

　　從上述實(shí)驗(yàn)可以看出，酶底物法快速檢測(cè)水中菌落總數(shù)的檢測(cè)結(jié)果與平皿計(jì)數(shù)法無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差別，是科學(xué)的、有效的、準(zhǔn)確的，可以用作評(píng)價(jià)水質(zhì)微生物污染的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。酶底物法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果判讀容易、準(zhǔn)確，無(wú)需稀釋即可檢測(cè)738個(gè)/1mL水樣，不僅適用于水源水、飲用水的檢測(cè)，還適用于應(yīng)急檢測(cè)和污水檢測(cè)，易于推廣，可以較好的彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足。